Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) имеют широкий спектр источников. МСК костномозгового происхождения наиболее широко изучены, но их пролиферативная способность относительно слаба и снижается с возрастом донора. МСК жирового происхождения легко получить, они обладают лучшей иммуномодулирующей способностью, чем МСК костномозгового происхождения, и демонстрируют сильную пролиферативную способность на ранней стадии. МСК, полученные из пуповины, известные своими характеристиками «клеток нулевого возраста» и низкой иммуногенностью, пользуются большой популярностью и стали горячей точкой для исследований. Поэтому при клинической трансформации и применении чаще используют МСК пуповины и жировой ткани.
Обработка образцов, как «первый шаг» в культуре МСК in vitro, напрямую определяет успех или неудачу последующих экспериментов. В этом руководстве основное внимание будет уделено распространенным проблемам, связанным с отбором и обработкой образцов пуповины, что поможет вам легко начать работу перед посевом.
Вопрос: Как выбрать подходящие пуповины для культивирования МСК, полученных из пуповины?
Выбор пуповины также является решающим звеном для беспрепятственного проведения эксперимента по первичной изоляции МСК пуповины.
Условия качественной пуповины:
Отсутствие явного отека или застоя в пуповине;
Густой Уортонов студень (WJ) в пуповине;
Свежую пуповину желательно использовать сразу после сбора и хранить не более 48 часов;
Мать-донор не имеет инфекционных заболеваний.
Условия хранения и транспортировки пуповины:
Пуповину следует хранить в консервационном растворе при температуре 4 ℃. При транспортировке в сухом состоянии он склонен к отеку и замедлению миграции клеток из ткани;
Пуповину следует использовать в течение 48 часов после сбора; существует определенная вероятность того, что ни одна клетка не выйдет из пуповины, хранившейся более 72 часов;
Пуповину необходимо хранить в консервационном растворе, содержащем 1% антибиотиков; в противном случае существует высокий риск заражения.
Вопрос: На какие вопросы следует обратить внимание при выборе пуповины?
Отек пуповины и прозрачный или полупрозрачный вартонов студень могут привести к тому, что меньшее количество клеток и медленнее мигрируют из тканевых блоков;
Перекрученная или атрофичная пуповина может привести к медленной миграции клеток из тканевых блоков;
Сильная перегрузка пуповины может вызвать медленную миграцию клеток из блоков ткани, и в культуральной чашке можно увидеть большое количество эритроцитов;
Неправильная работа при перерезании и удалении пуповины из родильного зала может привести к инфицированию.
Рекомендуемые решения:
Отберите пухлые пуповины без отека и сильной конгестии и отсеките небольшие отечные, атрофические или перегруженные участки. Если в лаборатории не часто происходит контаминация, пуповину можно промыть 3–5 раз физиологическим раствором, содержащим 1% двойных антител (пенициллин и стрептомицин) или 25 мг/л гентамицина. При частом обнаружении заражения пуповину сначала промывают 75% этанолом в течение 40–60 секунд, затем промывают 10–20 раз большим количеством физиологического раствора, содержащего 1% двойных антител.
Вопрос: Каковы классификации мезенхимальных стволовых клеток пуповины?
Пуповина – это пуповина, соединяющая плод и плаценту, отвечающая за газообмен, снабжение питательными веществами и выведение продуктов обмена между матерью и плодом. Его основные характеристики следующие:
Время развития: Начинает развиваться через 4-8 недель после формирования эмбриона человека;
Морфологические данные: Средняя длина 55 см, диаметр 14,42 мм, масса 40 г;
Структурный состав: С поверхности покрыт амниотической оболочкой (беловатого цвета), внутри содержит 1 пупочную вену и 2 пупочные артерии. Кровеносные сосуды окружает бесцветная и полупрозрачная коллоидная ткань — Уортоново желе (WJ), основная функция которого — защита пупочных кровеносных сосудов.
Мезенхимальные стволовые клетки могут быть получены из четырех различных отделов пуповины и подразделяются на следующие четыре типа в зависимости от их источников: мезенхимальные стволовые клетки Уортона (WJ-MSC), периваскулярные мезенхимальные стволовые клетки (PV-MSC), субамниотические мезенхимальные стволовые клетки (SA-MSC) и амниотические мезенхимальные стволовые клетки (AM-MSC). Мезенхимальные стволовые клетки из этих четырех отсеков имеют разные методы выделения.
Вопрос: Каковы преимущества желейных мезенхимальных стволовых клеток Wharton (WJ-MSC)?
По сравнению с мезенхимальными стволовыми клетками из других отделов пуповины, WJ-МСК лучше проявляют себя с точки зрения пролиферативной способности, потенциала дифференцировки, безопасности и т. д.:
Преимущества количества и изоляции: Wharton's Jelly занимает большую часть пуповины, имеет наибольшую площадь поверхности и объем и содержит гораздо больше звездчатых мезенхимальных стволовых клеток, чем другие области. Его выделение не требует сложной ферментной обработки, а достаточное количество клеток можно получить с помощью краткосрочной культуры, что не только обеспечивает жизнеспособность и чистоту, но и снижает риск микробного заражения во время культивирования.
Более сильный потенциал дифференцировки: WJ-MSC обладают более выраженными способностями к остеогенной и хондрогенной дифференцировке, более высокой выживаемостью и скоростью пролиферации, а также более сильными способностями к пролиферации и регенерации.
Более высокая безопасность: низкая иммуногенность, не экспрессирует MHC-Ⅱ; неканцерогенен и обладает противовоспалительными свойствами.
Вопрос: Как изолировать Уортоново желе от пуповины?
Медицинскими ножницами разрежьте пуповину на сегменты ткани длиной 2 см и надрежьте каждый сегмент вдоль пупочной вены. Используйте щипцы для тканей, чтобы отделить интиму пупочной вены, внешнюю кожу и две пупочные артерии, чтобы полностью обнажить желе Уортона.
Желе Уортона должно быть полностью очищено от трех кровеносных сосудов и внешнего эпидермиса. Если не полностью удалить эпителиоподобные гетерологичные клетки, они мигрируют наружу, занимая пространство роста МСК и приводя к уменьшению количества собранных клеток. Эти клетки трудно переваривать мягкими ферментами, и их можно удалить путем прохождения. Обработанную пуповину можно использовать для последующей прививки методом имплантации.
Вопрос: На какие проблемы следует обратить внимание при прививке методом имплантации?
Разрезание на блоки
Выделенное вартоновское желе следует нарезать небольшими кусочками примерно по 3 мм. Если кусочки ткани слишком малы, их будет трудно приклеить к стенке, в результате чего клетки не мигрируют или их будет слишком мало. Если кусочки ткани слишком велики или разрезаны не полностью, клетки также не мигрируют. Если кусочки ткани полностью измельчить ножницами, это может привести к неудаче первичной культуры клеток.
Прививка
Кусочки ткани следует инокулировать в подходящую среду в соответствии с размером культуральной чашки/колбы и добавлять соответствующее количество культуральной среды. Слишком мало культуральной среды предотвратит миграцию клеток из кусочков ткани, а слишком большое приведет к тому, что кусочки ткани будут всплывать, и клетки все равно не будут мигрировать.
После инокуляции кусочки ткани следует по возможности избегать перемещения. Лучше всего держать их в инкубаторе в полном покое в течение первых 7 дней, за исключением добавления среды. Частое движение приведет к зависанию кусочков ткани, что сделает невозможным миграцию клеток.
